提供了包含融合蛋白并且基本不含核酸的病毒样颗粒,其中融合蛋白包含植物病毒衣壳蛋白和靶蛋白。包含该病毒样颗粒的免疫原性组合物可以被施用给受试者以在受试者中引起保护性免疫应答。还提供了产生该病样颗粒的方法。
1.包含融合蛋白的病毒样颗粒,其中融合蛋白包含植物病毒衣壳蛋白和靶蛋白,其中植物病毒衣壳蛋白源自苜蓿花叶病毒的衣壳蛋白,其中靶蛋白选自由恶性疟原虫性阶段蛋白pfs25、恶性疟原虫性阶段蛋白pfs28、血凝素球形域A/安徽/1/2005(H5N1)和血凝素球形域A/印度尼西亚/5/2005(H5N1)组成的组,其中病毒样颗粒通过融合蛋白自装配,并且其中病毒样颗粒包含按重量小于10%的核酸。
2.权利要求1的病毒样颗粒,其中靶蛋白源自细胞内病原体的细胞表面多肽。
3.权利要求1或2的病毒样颗粒,其中靶蛋白源自恶性疟原虫的细胞表面多肽。
4.权利要求1-3任一项的病毒样颗粒,其中靶蛋白源自流感病毒的血凝素多肽。
5.权利要求4的病毒样颗粒,其中流感病毒是选自由H1N1、H3N2、H5N1和H7N7组成的组的A型流感病毒。
6.权利要求4的病毒样颗粒,其中流感病毒是B型流感病毒。
7.权利要求1-6任一项的病毒样颗粒,其中靶蛋白由选自由SEQxa0IDxa0NOs:4-6和11组成的组的氨基酸序列组成。
8.权利要求1-7任一项的病毒样颗粒,其中靶蛋白融合到植物病毒衣壳蛋白的N末端。
9.权利要求1-8任一项的病毒样颗粒,其中病毒样颗粒在选自由细菌、真菌、植物、昆虫、两栖动物和哺乳动物细胞组成的组的宿主细胞中产生。
10.包含病毒样颗粒的免疫原性组合物,其中病毒样颗粒包含融合蛋白,其中融合蛋白包含植物病毒衣壳蛋白和靶蛋白,其中植物病毒衣壳蛋白源自苜蓿花叶病毒的衣壳蛋白,其中靶蛋白选自由恶性疟原虫性阶段蛋白pfs25、恶性疟原虫性阶段蛋白pfs28、血凝素球形域A/安徽/1/2005(H5N1)和血凝素球形域A/印度尼西亚/5/2005(H5N1)组成的组,其中病毒样颗粒自装配,并且其中病毒样颗粒包含按重量小于10%的核酸。
11.权利要求10的免疫原性组合物,进一步包含佐剂。
12.权利要求11的免疫原性组合物,其中佐剂选自由铝盐、油水乳剂和基于皂苷的佐剂组成的组。
13.权利要求10的免疫原性组合物,其中靶蛋白由选自由SEQxa0IDxa0NOs:4-6和11组成的组的氨基酸序列组成。
14.包含免疫有效量的组合物的药物,所述组合物包含对于诱导受试者中对细胞内病原体的保护性免疫应答有用的病毒样颗粒,其中病毒样颗粒包含融合蛋白,其中融合蛋白包含植物病毒衣壳蛋白和源自细胞内病原体的靶蛋白,其中植物病毒衣壳蛋白源自苜蓿花叶病毒的衣壳蛋白,其中靶蛋白选自由恶性疟原虫性阶段蛋白pfs25、恶性疟原虫性阶段蛋白pfs28、血凝素球形域A/安徽/1/2005(H5N1)和血凝素球形域A/印度尼西亚/5/2005(H5N1)组成的组,其中病毒样颗粒自装配,并且其中病毒样颗粒包含按重量小于10%的核酸。
15.权利要求14的药物,其中靶蛋白由选自由SEQxa0IDxa0NOs:4-6和11组成的组的氨基酸序列组成。相关申请的交叉引用本专利申请要求2009年9月18日提交的美国临时申请号61/243,774和2010年5月25日提交的美国临时申请号61/348,069的优先权,两者的全部内容纳入本发明作为参考。发明领域本发明总体涉及重组疫苗领域。更具体地说,本发明涉及用于疫苗中的、包含与植物病毒衣壳蛋白融合的靶蛋白的病毒样颗粒,以及产生该病毒样颗粒的方法。发明背景植物病毒是抗原产生和递送的有效工具。多种重要的蛋白抗原已经在转基因植物中表达,但产生的抗原蛋白水平相对较低。为试图解决这个问题,已设计了植物病毒衣壳蛋白来用作融合抗原多肽的载体分子并用于瞬时表达系统中。衣壳蛋白有自装配并形成重组病毒颗粒的能力,所述重组病毒颗粒在其表面展示理想的抗原表位或外来多肽。由于重组病毒在细胞质中复制,理想的抗原表位或外来多肽可能因为在翻译后水平修饰不足或不正确的折叠而不能被正确的展示。由重组烟草花叶病毒(TMVs)或豇豆花叶病毒感染而在植物中产生的抗原,在注入小鼠中时已经显示能诱导特异性抗体。然而,在这些系统中,当长度大于25个氨基酸的多肽与其衣壳蛋白融合时,病毒不能装配。在不同的系统中,长至47个氨基酸的多肽与苜蓿花叶病毒(AIMV)衣壳蛋白的融合没有阻碍病毒装配,而得到的包含病毒核酸的病毒颗粒是有效的免疫原(Yusibov,V.,etxa0al.,PNASxa094:5784-5788,1997)。最近,已经开发出了一种方法:使用一15个氨基酸的连接肽,将蛋白A的功能性片段(133个氨基酸)附加到TMV衣壳蛋白的C末端。得到的病毒结构可以装配成能感染叶组织并在组织中移动的病毒颗粒(Werner,S.,etxa0al.,PNASxa0103:17678-17683,2006)。然而,所有这些系统都得到含病毒RNA的感染性病毒颗粒。使用这样的颗粒诱导保护性免疫应答,即作为疫苗,将会使受试者接种病毒的RNA以及预定的免疫原。仍然有对在病毒样颗粒的表面展示理想的抗原表位或外来多肽的免疫方法和材料的需求,其中病毒样颗粒基本不含病毒核酸。发明概述本发明公开的主题提供了病毒样颗粒以及使用和制备该病毒样颗粒的方法。根据本发明的一个方面,提供了病毒样颗粒。病毒样颗粒包含融合蛋白并基本不含核酸,其中融合蛋白包含植物病毒衣壳蛋白和靶蛋白。病毒样颗粒可以在选自由细菌、真菌、植物、昆虫、两栖动物和哺乳动物细胞组成的组的宿主细胞中产生。靶蛋白可以融合到植物病毒衣壳蛋白的N末端。植物病毒衣壳蛋白可以源自选自由苜蓿花叶病毒,高粱花叶病毒和马铃薯Y病毒组成的组的植物病毒的衣壳蛋白。靶蛋白可以源自细胞内病原体的多肽。靶蛋白可以源自恶性疟原虫的细胞表面多肽或流感病毒的血凝素多肽。流感病毒可以是选自由H1N1、H3N2、H5N1、和H7N7组成的组的A型流感病毒。流感病毒也可以是B型流感病毒。靶蛋白可以包含选自由SEQxa0IDxa0NOs:4-11和49及其抗原片段组成的组的氨基酸序列。根据本发明另一个方面,提供了免疫原性组合物。免疫原性组合物包含病毒样颗粒。免疫原性组合物进一步包含佐剂。佐剂可以选自由铝盐、油水乳剂和基于皂苷的佐剂组成的组。在某些实施方案中,植物病毒衣壳蛋白源自苜蓿花叶病毒衣壳蛋白,而靶蛋白包含选自由SEQxa0IDxa0NOs:4-11和49及其抗原片段组成的组的氨基酸序列。提供了在受试者中引起对细胞内病原体的保护性免疫应答的方法。该方法包含给受试者施用免疫有效量的包含第一病毒样颗粒的第一组合物,其中第一病毒样颗粒包含第一融合蛋白并基本不含核酸,其中第一融合蛋白包含植物病毒衣壳蛋白和源自第一细胞内病原体的第一靶蛋白。在某些实施方案中,植物病毒衣壳蛋白源自苜蓿花叶病毒衣壳蛋白,而第一靶蛋白包含选自由SEQxa0IDxa0NOs:4-11和49及其抗原片段组成的组的氨基酸序列。在某些其他实施方案中,组合物进一步包含佐剂。该方法进一步包含在施用第一组合物之前给受试者施用免疫有效量的包含第二病毒样颗粒的第二组合物,其中第二病毒样颗粒包含第二融合蛋白并基本不含核酸,其中第二融合蛋白包含植物病毒衣壳蛋白和第二靶蛋白。第二靶蛋白可以源自不是第一细胞内病原体的第二细胞内病原体。在某些实施方案中,第一靶细胞内病原体可以是流感病毒,植物病毒衣壳蛋白源自苜蓿花叶病毒衣壳蛋白,第一靶蛋白包含选自SEQxa0IDxa0NOs:6-11组成的组的氨基酸序列,而第二靶蛋白包含选自SEQxa0IDxa0NOs:4、5和49组成的组的氨基酸序列。特别是,第一和第二靶蛋白可以分别包含SEQxa0IDxa0NOs:6和4的氨基酸序列。还提供了在包含编码融合蛋白的核苷酸序列的宿主细胞中产生病毒样颗粒的方法,其中病毒样颗粒包含融合蛋白并基本不含核酸,而融合蛋白包含植物病毒衣壳蛋白和靶蛋白。该方法包含在允许宿主细胞内病毒样颗粒装配的条件下在宿主细胞中表达融合蛋白。该方法进一步包含从宿主细胞中纯化病毒样颗粒。在某些实施方案中,宿主细胞为选自由细菌、真菌、植物、昆虫、两栖动物和哺乳动物细胞组成的组的细胞。当宿主细胞是植物细胞时,方法可以进一步包含使用能够感染植物细胞的重组细菌感染植物细胞,其中该重组细菌包含编码融合蛋白的核苷酸序列。在某些其他实施方案中,靶蛋白源自细胞内病原体。在另外某些其他实施方案中,植物病毒衣壳蛋白源自苜蓿花叶病毒衣壳蛋白,而靶蛋白包含选自SEQxa0IDxa0NOs:4-11和49及其抗原片段组成的组的氨基酸序列。附图简述图1示意性说明了植物病毒衣壳蛋白与靶蛋白融合以及融合蛋白自装配成病毒样颗粒。图2显示了(A)包含融合蛋白(CP融合构建体)和信号序列(PR1a)的示例性基因构建体;(B)将CP融合构建体克隆进表达载体pGR-D4;和(C)将CP融合构建体克隆进表达载体pBI121。RB和LB代表通过重组农杆菌导入植物细胞的区域的右和左边界。图3显示了恶性疟原虫Pfs25(上栏)、Pfs28(中栏)、或流感病毒HA3A靶蛋白(下栏)与AIMV衣壳蛋白融合蛋白组成的病毒样颗粒的透射电镜图。病毒样颗粒被负染(左栏),和使用以免疫金标记的、分别对每种靶蛋白特异的抗体进行标记(右栏)。如标示,比例尺=100nm或200nm。图4A和4B显示了纯化的(A)Pfs25或(B)HA3A与AIMV衣壳蛋白融合成的融合蛋白的免疫印迹。每个印迹的右半部分是与抗AIMV抗体孵育。每个印迹的左半部分是与抗(A)Pfs25或(B)HA3A的单克隆抗体孵育。图4C是包含与全长血凝素HAA靶蛋白融合的AIMV衣壳蛋白的植物蛋白粗提物的免疫印迹,所述植物蛋白在不同条件下提取以评价溶解性。印迹是与抗-HAA单克隆抗体进行反应。TSP=总可溶蛋白;TSP-T=Triton提取可溶蛋白;TP=总蛋白。图5A显示了使用含HA3A-CPF(CPF指“衣壳蛋白融合物”)的VLPs,有或没有佐剂,QUILxa0A^TM或ALHYDROGEL^TM,或有QUILA^TM的HAA1免疫28或56天后,小鼠血清样品中抗-A/安徽/1/05的IgG反应。图5B显示了来自与图5A相同小鼠的血清样品中的血清血凝抑制(HI)的抗体反应。图6显示了使用含Pfs25-CPF或Pfs28-CPF的VLPs,有或没有佐剂,QUILxa0A^TM或ALHYDROGEL^TM,免疫56天后,小鼠中收集到的血清样品的IgG滴度。图7显示了使用HAI3-CPFxa0VLPs或HAI1,有或没有ALHYDROGEL^TM,或者单独的CP,免疫35天后,小鼠中收集到的血清样品的抗-A/印度尼西亚/5/05IgG的同种型滴度。图8显示了使用HAI3-CPFxa0VLPs或HAI1,有或没有ALHYDROGEL^TM,或单独的CP免疫后,小鼠血清样品的血清血凝抑制(HI)的抗体反应。图9A和9B显示了使用Pfs25-CPFxa0VLPs或PBS,有或没有ALHYDROGEL^TM,初次免疫,并使用PBS或HA3A-CPFxa0VLPs,有或没有ALHYDROGEL^TM,二次免疫后,小鼠血清样品的抗-A/安徽/1/05的血清血凝抑制(HI)的抗体反应。发明详述本发明总体涉及包含融合蛋白并基本不含核酸的病毒样颗粒(VLPs),以及使用和制备该病毒样颗粒的方法。本发明中使用的术语“病毒样颗粒”或“VLP”是指源于病毒的,例如下文讨论的植物病毒的,不可复制的病毒外壳。VLPs一般由至少一种病毒蛋白(如壳体、衣壳、外壳、表面或包膜蛋白)组成,其能在多种适合的宿主细胞中,例如细菌、真菌、植物、酵母、昆虫、两栖动物和哺乳动物细胞中随病毒蛋白表达而自发形成。VLPs的存在可以使用本领域已知常规技术检测(如电子显微镜、动态光散射、和体积排阻色谱),VLPs也可以使用本领域常规技术分离(如密度梯度离心法、体积排阻色谱、和亲和层析)。本发明中术语“蛋白”和“多肽”可交换使用,是指氨基酸残基聚合物,其没有对聚合物最小长度的限制。该定义包含全长蛋白及其片段,及其修饰形式(如糖基化、磷酸化、缺失、加入和取代)。本发明中使用的术语“源自”是指源头或来源,其可以包含自然发生的、重组的、未纯化的或纯化的分子。本发明中使用的术语蛋白的“片段”是指具有与蛋白氨基酸序列的一部分,但非全部相同的氨基酸序列的多肽。本发明中使用的术语蛋白的“变体”是指除了具有的至少一个修饰的氨基酸,例如缺失、插入、或取代,具有与蛋白氨基酸序列相同的氨基酸序列的多肽。变体可以具有与蛋白氨基酸序列至少约80%、90%、95%、或99%、优选至少约90%、更优选至少约95%相同的氨基酸序列。本发明中使用的术语“抗原”是指包含一个或多个能够刺激受试者免疫系统以生成体液和/或细胞抗原特异性反应的表位(线性和/或构象的)的分子。体液免疫应答是指通过B淋巴细胞、或B细胞产生的抗体介导的免疫应答,而细胞免疫应答是指通过T淋巴细胞、或T细胞、和/或其他白细胞介导的免疫应答。通常,B细胞表位包含至少约5个氨基酸,但可以是3-4个氨基酸,而T细胞表位包含至少约7-9个氨基酸,辅助T细胞表位包含至少12-20个氨基酸。抗原可以源自细胞内病原生物或病原体的蛋白(如表面蛋白)。本发明中使用的术语“免疫原性组合物”是指包含抗原分子,并且将组合物施用给受试者能够在受试者中引起体液和/或细胞抗原特异性反应的组合物。本发明中使用的术语“受试者”是指哺乳动物,优选人。本发明中使用的术语“约”,当指可测量值,如量、百分数等时,表示包含从指定值±20%或±10%、更优选±5%、甚至更优选±1%、再更优选±0.1%的变化,而这样的变化适合进行该公开的方法。根据本发明的一个方面,提供了病毒样颗粒(VLP)。VLP包含融合蛋白并基本不含核酸,其中融合蛋白包含植物病毒衣壳蛋白和靶蛋白。图1示意性说明了靶蛋白与植物病毒衣壳蛋白的融合物可形成VLP装配,其将靶蛋白展示在VLP的表面。植物病毒衣壳蛋白可以源自能够自装配为基本不含核酸的颗粒的、任何病毒的衣壳蛋白。植物病毒衣壳蛋白可以是全长的衣壳蛋白,或其功能性片段或变体。适合的植物病毒衣壳蛋白的例子,包含源自苜蓿花叶病毒(AIMV-CP、CP或CPF)、马铃薯Y病毒(Stram,etxa0al.,Virusxa0Researchxa028:29-35,2002)和高粱花叶病毒(Jagadixa0sh,etxa0al.,J.Gen.Virol.74:893-896,1993)衣壳蛋白的蛋白。可以遗传修饰衣壳蛋白的氨基酸序列以改善颗粒的装配或免疫原性。衣壳蛋白的氨基酸序列可以被缺失、插入、或取代,前提是所得到的衣壳蛋白变体当与靶蛋白融合时,在缺少核酸的情形下它仍然能够装配成颗粒。当片段或变体能够自装配为基本不含核酸的颗粒时,衣壳蛋白的片段或变体是功能性的。例如,SEQxa0IDxa0NO:1代表的蛋白缺少天然AIMV-CP序列的第一个蛋氨酸(从起始密码子),而SEQxa0IDxa0NO:2代表的蛋白是AIMV-CP序列的截短片段,其缺少天然蛋白序列的前25个氨基酸。靶蛋白可以源于任何来源的任何理想的抗原或多肽。其可以具有至少约6、10、50、100、200、300、或500个氨基酸。优选的靶蛋白源于适用于疫苗的,细胞内病原生物,如细菌、病毒、真菌和寄生生物的表面蛋白。病毒生物的例子包含恶性疟原虫或流感病毒。流感病毒包含A型流感病毒多种病毒株(如H1N1、H3N2、H5N1、和H7N7)和B型流感病毒。源自表面蛋白的靶蛋白可以是全长的表面蛋白或其片段或变体。例如,靶蛋白可以源自恶性疟原虫的细胞表面多肽,或流感病毒的血凝素多肽。为用于疫苗,优选的片段或变体为抗原性的片段或变体,即其能够诱导受试者中的保护性免疫应答。片段或变体的长度具有至少约6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸。只要当其与植物病毒衣壳蛋白融合时能自装配出基本不含核酸的颗粒,任何蛋白、蛋白片段、或蛋白变体都可以用作靶蛋白。靶蛋白的一些例子由序列表中的SEQxa0IDxa0NOs:4-19和23-49所描述。靶融合蛋白可以进一步包含信号序列,以将融合蛋白靶向至宿主细胞的特定位置(如ER、叶绿体),或者引导融合蛋白的细胞外分泌。没有信号肽会导致蛋白在细胞质中翻译。可以使用任何适合宿主细胞的信号序列,或者可以省略信号序列。已发现信号序列跨门和界保守,通常,可以使用几乎任何信号序列。Bennettxa0andxa0Scheller,PNASxa090:2559-2563,1993;Luirinkxa0andxa0Sinning,Biochim.Biophys.Actaxa01694:17-35,2005;Doudnaxa0andxa0Batey,Ann.Rev.Blochem.73:539-557,2004;Stern,etxa0al.,Trendsxa0inxa0Cellxa0andxa0Mol.Biol.2:1-17,2007。在植物组织中表达的一个实施方案中,优选的信号序列是普通烟草的植物病程相关蛋白1(PR-1)(SEQxa0IDxa0NO:3)。可以使用标准的克隆和分子生物学方法制备融合蛋白,如按照实施例1的描述。可以制备包含植物病毒衣壳蛋白和靶蛋白编码序列的示例性构建体,并将其亚克隆进表达载体(图2)。靶蛋白可以直接或间接(如通过连接肽)与植物病毒衣壳蛋白融合。例如,可以通过将靶蛋白编码序列置于植物病毒蛋白编码序列5’端,来将靶蛋白融合到植物病毒衣壳蛋白N末端(图2)。表达构建体可选的包含信号序列以引导融合蛋白的定位或分泌。使用本领域已知的常规技术(如转染、转导、感染和电穿孔),表达载体可以被引入适合的表达系统以在宿主细胞中表达融合蛋白。可以使用任何适合所选宿主细胞的表达系统,包含质粒和病毒载体。适合的宿主细胞包含细菌、哺乳动物、植物、真菌、两栖类和昆虫细胞。使用质粒和病毒载体来在植物细胞中表达融合蛋白,在实施例1-3中有描述。可以创制转基因生物以产生融合蛋白。在这些宿主系统中产生重组蛋白并分离和纯化重组蛋白所用的适合的表达载体和方法在本领域中已知,并在例如牛津大学出版社出版的“Practicalxa0Approach”系列,其包含Proteinxa0expression,axa0Practicalxa0Approach,S.J.Higginsxa0andxa0B.D.Hames,Eds.,1999;Molecularxa0Plantxa0Biologyxa0Vols.1xa0andxa02,P.M.Gilmartinxa0andxa0C.Bowler,Eds.,2002;Proteinxa0Purificationxa0Techniques,Axa0Practicalxa0Approach,S.Roe,Ed.,2001;以及休曼出版社出版的′′Methodsxa0Inxa0Molecularxa0Biology/Medicine′′系列,其包含Transgenicxa0Plants:Methodsxa0andxa0Protocols,Leandrontent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="140"/>Ed.,2004;Baculovirusxa0andxa0Insectxa0Cellxa0expressionxa0Protocols,D.W.Murhammer,Ed.,2007;和Adenovirusxa0Methodsxa0andxa0Protocols,Vols.1xa0andxa02,W.S.M.Woldxa0andxa0A.E.Tollefson,Eds.,2007中描述。本发明也包含分离的,编码包含植物病毒衣壳蛋白和靶蛋白的融合蛋白的多核苷酸。多核苷酸通过任何本领域已知的适合方法获得。例如,靶蛋白或其片段或变体的核苷酸序列,或者衣壳蛋白或其片段或变体的核苷酸序列可能已知,或者可以通过筛选库和测序潜在的靶或衣壳蛋白来确定。可选的,可以反向翻译特定融合蛋白的氨基酸序列来获得适合的核苷酸序列并合成制备对应的核苷酸。本发明的VLPs特别利于抗原呈递。该VLPs是高度免疫原性的。而且,该VLPs基本不含核酸。例如,按照诸如TEM和负染的观察该颗粒可以显示为空。颗粒可以包含按重量小于约10%、5%、1%、或0.1%,优选小于约5%,更优选小于约1%的核酸。因此,其提供对病毒、细菌、和真核病原体安全而有效的疫苗。提供了包含VLPs的免疫原性组合物。组合物施用给受试者时免疫原性组合物能在受试者中诱导对靶蛋白的免疫应答(即体液和/或细胞反应)。在某些实施方案中,靶蛋白源自细胞内病原体,而组合物施用给受试者时免疫原性组合物能在受试者中引起对病原体的保护性免疫应答。免疫原性组合物可以被配制为包包含效量VLPs、药学可接受载体、稀释剂和/或赋形剂的药物组合物。“有效量”是指显示出可检测的免疫增强效果所需要的VLPs量。有效量取决于施用途径,配方性质,和受试者的条件。“有效量”的适合范围可以从每千克受试者体重约0.001到约100μg病毒样颗粒(或融合蛋白颗粒)。适合的载体、稀释剂、和赋形剂在本领域中已知,包含,但不限于盐水、盐缓冲液、甘露醇、L组氨酸、聚山梨醇酯80、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其组合。组合物可选的包含佐剂。适合的佐剂包含铝盐(如Alhydrogel^TM)、油水乳剂和基于皂苷的佐剂(Quilxa0A^TM)免疫原性组合物可以被配制成口腔、肛门、透皮、鼻腔、粘膜、非肠道给药形式。非肠道给药包含皮下、肌肉、腹腔、和静脉注射。也提供了在受试者中诱导对第一细胞内病原体的保护性免疫应答的方法。该方法包含给受试者施用包含第一病毒样颗粒的第一免疫原性组合物,其中第一病毒样颗粒包含第一融合蛋白并基本不含核酸,其中第一融合蛋白包含植物病毒衣壳蛋白和源自第一细胞内病原体的第一靶蛋白。组合物可以进一步包含佐剂。该方法可以进一步包含在施用第一免疫原性组合物之前给受试者施用包含第二病毒样颗粒的第二免疫原性组合物,其中第二病毒样颗粒包含第二融合蛋白并基本不含核酸,其中第二融合蛋白包含植物病毒衣壳蛋白和第二靶蛋白。第二靶蛋白可以源自不是第一细胞内病原体的第二细胞内病原体。在某些实施方案中,靶细胞内病原体是流感病毒毒株而第一靶蛋白源自不同的细胞内病原体(如疟疾寄生虫、恶性疟原虫)或不同的流感病毒毒株。例如,靶病原体是流感病毒,植物病毒衣壳蛋白源自苜蓿花叶病毒衣壳蛋白,第一靶蛋白包含SEQxa0IDxa0NO:6、7、8、9、10或11的氨基酸序列,而第二靶蛋白包含SEQxa0IDxa0NO:4、5、或49的氨基酸序列。还提供了在宿主细胞中产生VLP的方法。该方法包含在允许宿主细胞内病毒样颗粒(VLP)装配的条件下,在包含编码融合蛋白的核苷酸序列的宿主细胞中,表达包含植物病毒衣壳蛋白和靶蛋白的融合蛋白。例如,在带有相应融合构建体的表达载体浸润入植物3-7天后,VLP可以在植物组织中装配。VLP包含融合蛋白并基本不含核酸。方法可以进一步包含从宿主细胞中纯化VLP。适合的宿主细胞包含细菌、真菌、植物、昆虫、两栖动物和哺乳动物细胞。编码融合蛋白的核苷酸序列可以整合或不整合入宿主细胞基因组。宿主细胞是植物细胞时,该方法进一步包含使用能够感染植物细胞的重组细菌感染植物细胞(如根癌农杆菌菌株CV3101和其他感染性根癌农杆菌菌株,以及感染性毛根农杆菌菌株),其中的重组细菌包含编码融合蛋白的核苷酸序列。下面的实施例描述了包含源自疟疾寄生虫,恶性疟原虫、流感病毒A/安徽/1/2005(H5N1)和流感病毒A/印度尼西亚/5/2005(H5N1)靶蛋白的示例性融合蛋白的制备和测试。当这些靶蛋白与AIMV衣壳蛋白融合时,得到的融合蛋白装配成明显空的VLPs。这些颗粒与对AIMV特异的抗体和对靶蛋白特异的抗体相结合。使用含疟疾靶蛋白的VLPs免疫小鼠的血清,产生了高滴度的该寄生虫的结合抗体,并且能够防止蚊子中的该寄生虫传播(表2和3)。如实施例4和8中描述和图5、7和8中所显示,使用含流感病毒蛋白的VLP免疫的小鼠,产生了保护水平的抗体滴度。如实施例9描述和图9所显示,预先存在的对植物病毒衣壳蛋白的免疫力,不干扰使用包含相同植物病毒衣壳蛋白的VLPs免疫的小鼠中保护水平的抗体滴度。实施例1表达AIMV-CP融合蛋白的异种载体的构建靶基因包含对疟疾寄生虫,恶性疟原虫不同性阶段(Pfs25(SEQxa0IDxa0NO:4)、Pfs28(SEQxa0IDxa0NO:5)、和Pfs230(SEQxa0IDxa0NO:49))、流感病毒安微株血凝素(HA)球形域(HA3A(SEQxa0IDxa0NO:6))、流感病毒加利福尼亚株HA球形域(HA3C04(SEQxa0IDxa0NO:7)和HA3C06(SEQxa0IDxa0NO:8))、流感病毒印度尼西亚株HA球形域(HA3I(SEQxa0IDxa0NO:11))、安徽株全长HA(HAA或HAA1(SEQxa0IDxa0NO:9))、和印度尼西亚株全长HA(HAI或HAI1(SEQxa0IDxa0NO:10))特异的细胞表面蛋白。使用分子生物学标准方法将每个靶基因克隆为AIMV衣壳蛋白(AIMV-CP、CP、或CPF)、或优化的AIMV衣壳蛋白(CPO)的N末端融合物,其中优化的AIMV衣壳蛋白由为在植物中表达而优化的编码序列编码,所述融合物在使用PacI和BsmBI限制性内切酶的穿梭载体中。图2显示了融合蛋白构建体的示例性结构。序列通过自动测序验证。随后将每个靶-CP序列亚克隆进表达载体,其可选编码植物病程相关蛋白1(PR-1)信号肽(SEQxa0IDxa0NO:3)。具体的,序列被亚克隆进pBI121的BamHI-SacI位点(Clontech)、或pGRD4的PacI-XhoI位点(Shoji,etxa0al.,Vaccinexa027:108701092,2009中描述)。克隆策略示于图2。实施例2使用带有融合构建体的表达载体浸润植物随后将实施例1产生的表达载体引入根癌农杆菌菌株GV3101,得到的细菌在基本培养基中生长过夜。测定培养物的光密度并将表达蛋白的菌株与表达沉默蛋白抑制子p19的农杆菌菌株以4∶1的比率混合至终O.D.0.5。如前所述,农杆菌溶液通过手工浸润被引入6周龄,土壤种植的本氏烟草植株的地上部分(Greenxa0etxa0al.,Biotechnol.J.4:1-8,2009)。浸润后3-7天取植物组织样品来确定融合蛋白的表达水平和溶解度。样品被称量并在3体积的提取缓冲液中(100mMxa0Na₂HPO₄,pH7.1;2.5mMxa0EDTA,pH8.0)提取总可溶蛋白,在加0.5%Triton-Xxa0100的提取缓冲液中提取Triton总可溶蛋白,或者在凝胶加样缓冲液中提取总蛋白。蛋白溶解在10%的SDS-PAGE胶中并被转到PVDF膜上。通过将使用抗-AIMV兔多克隆抗体与使用AIMV标准品或使用靶特异性抗体和合适标准品的免疫印迹分析相比较,来评估融合蛋白的水平。代表性的免疫印迹示于图4C。确定了表达的峰值日和溶解曲线。将感兴趣的构建体大规模真空浸润进水耕的本氏烟草中来表达融合蛋白。实施例3病毒样颗粒的分离和纯化在最大表达日,收获叶片并在搅拌器中于3体积带0.5%TritonX-100的磷酸提取缓冲液中匀浆。匀浆物在4°C搅拌30分钟,然后5,000×g离心30分钟。用神奇滤布(miracloth)过滤上清并在15,000×g离心1到1.5小时。使用PEG沉淀上清并再次15,000×g离心30分钟。团块重悬浮于磷酸缓冲液中并在-20°C冷冻。解冻后,悬液在30,000×g离心30分钟。通过SDS-PAGE检测悬液等份来测算蛋白浓度。悬液在Ti70转子中60,000×g离心2小时。团块重悬浮于磷酸缓冲液中。使用SDS-PAGE和考马斯蓝染色来分析得到的悬液。通过与BSA标准品对比,来比色确定蛋白浓度。通过TEM和负染来观察纯化的颗粒(图3)。颗粒显示为空的并基本不含核酸。使用靶特异性抗体的免疫金标记确认颗粒表面靶蛋白的存在。纯化的颗粒在10mMxa0Na₂HPO₄,pH7.1;1mMxa0EDTA,pH8.0缓冲液中-80°C储存。如实施例3描述纯化的蛋白被用于免疫印迹。在有纯化颗粒的免疫印迹上,融合蛋白被靶特异抗体和可结合衣壳蛋白的AIMV特异抗体所识别(图4A和4B)。产生于叶片中的融合蛋白表达结果列于表1。表达和纯化量足够高以允许测试小鼠中的免疫原性。表1自侵润到植物叶中的融合构建体的蛋白表达ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="638"/>实施例4使用病毒样颗粒免疫小鼠在研究日第0和28天,使用10μg包含Pfs25-CPF或Pfs28-CPF的病毒样颗粒,或者1μg包含HA3A-CPF的病毒样颗粒皮下注射免疫多组6只6-8周龄的Balb/c小鼠。疫苗在使用前刚制备。等份纯化的病毒样颗粒(或融合蛋白颗粒)在缓冲液中被解冻并随或不随佐剂注射。疫苗仅在单独的PBS中注射,或者在存在QUILxa0A^TM(基于皂苷的佐剂,Brenntagxa0Blosector,Frederikssundxa0Denmark)或ALHYDROGEL^TM(基于氢氧化铝的佐剂,Brenntagxa0Biosector,Frederikssundxa0Denmark)作为佐剂的情况下注射。流感病毒安徽株的全长可溶HA(HAA1)也随QUILxa0A^TM注射作为阳性对照。在研究日56天收集血清样品并通过ELISA分析抗原特异IgG反应。在测试中,平板被覆盖上1μg/mL的下列蛋白:毕赤酵母中产生的重组Pfs25或Pfs28,或以1∶128稀释度的,从CDC获得的灭活A/安微/1/2005重配毒株覆盖。血清样品以4倍稀释度铺在平板上。以相应OD值是空白值4倍以上的稀释度,进行IgG的终点滴定。结果表明带或不带佐剂的Pfs25-CPF和Pfs28-CPF在第56天引起高抗体滴度(>10,000)(图6)。HA3A-CPF在存在或不存在佐剂的情况下也引起抗原特异性的抗体滴度(图5A)。为测试HA3A-CPF疫苗引起的抗体的功能性,如Yokoxa0etxa0al.(Vaccinexa027:3467-3470,2009)描述进行血凝抑制(HI)检测。结果显示所有使用PBS或QUILA^TM中的HA3A-CPF免疫的小鼠都具有>1∶40的HI滴度,该水平被认为在人中是有保护性的(图5B)。使用吸收到ALHYDROGEL^TM中的HA3A-CPF疫苗免疫的的五只动物中的四只具有>1∶40的HI滴度。基于这些结果,HA3A-CPF显示为大流行流感疫苗的可行候选受试者,其可以不用佐剂递送。使用不同组的测定来评价Pfs25-CPF和Pfs28-CPF疫苗引起的抗体的效果。第56天收集的血清中ELISA确定的IgG滴度示于图6。此外,这些血清样品被送至荷兰Nijmegen的Radboud大学以评估配子体结合抗体的存在。使用免疫荧光测定(IFA)在固定的配子体上完成血清初步测试,其中测定了每份血清样品中寄生虫结合抗体的滴度(表2)。IFA测试的阳性血清随后使用活配子体以1∶50和1∶250的血清稀释度在悬浮免疫荧光测定(SIFA)中进行分析。SIFA结果示于表2。表2疟疾CP-融合物疫苗效力xa0xa0疫苗候选物
xa0xa0佐剂
xa0剂量(μg)
xa0IFA(Ab滴度)
xa0xa0SIFA(Ab滴度)
xa0xa0Pfs25-CPF
xa0xa0Quilxa0A
xa010
xa0阳性(6400)
xa0xa0强阳性(250)
xa0xa0Pfs25-CPF
xa0xa0Alhydrogel
xa010
xa0阳性(6400)
xa0xa0强阳性(250)
xa0xa0Pfs25-CPF
xa0xa0PBS
xa010
xa0阳性(800)
xa0xa0强阳性(250)
随后在标准膜饲测定(SMFA)中测试了血清中传播阻断抗体的存在。SMFA测量是测试待测血清中传播阻断抗体的黄金标准。该生物测定模拟自然感染条件,因此被认为是测量人和蚊子之间传播的有价值的测定。该测试使得传播阻断疫苗(TBV)的发展,具有在大多数其他疟疾疫苗中所没有的可信度。简言之,使实验室饲养的斯氏按蚊从膜覆盖的装置中进食血液,该膜覆盖的装置包含连同补体的上述被免疫小鼠的血清以及恶性疟原虫该配子体感染的红细胞悬液。一周后,测定被感染的蚊子的数目(%感染的蚊子),以及每只蚊子发展出的卵囊数目。通过比较饲以测试和对照(免疫前)血清其蚊子中的卵囊数来确定传播降低活性。这些结果示于表3。表3标准膜饲测定ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>剂量为每种疫苗候选物10μgND=未确定;AMO=算数平均卵囊数/被饲者使用Pfs25-CPF产生的血清样品的分析表明寄生虫结合抗体的高滴度(1∶6400)在有佐剂组中被检测到,而疫苗单独可引起中等滴度(1∶800)。当在活寄生虫上分析时,所有三种Pfs25-CPF组合物,QUILxa0A^TM,ALHYDROGEL^TM,和单独的PBS显示出1∶250的抗体滴度。同样的,在SMFA中评价时,所有三种Pfs25-CPF配方在蚊子中诱导出了完全阻断寄生虫传播的血清。这些数据证实了该方法在产生有效的,不需要佐剂的抗感染性物质的疫苗中的潜力。实施例5制备腺病毒融合蛋白构建体以转染哺乳动物细胞为在哺乳动物系统中表达由AIMV-CP-融合蛋白组成的无病毒的颗粒(或融合蛋白颗粒),使用PCR技术以将Gaussia荧光酶素信号肽融合到HA3A-CPF和HA3C04-CPF上(分别为安徽HA的球形域(3)(SEQxa0IDxa0NO:6),和加利福尼亚04球形域(3)(SEQxa0IDxa0NO:7))。正向引物(SEQxa0IDxa0NO:20和21)包含TOPO整合序列(CACC)和编码荧光酶素信号肽与靶蛋白起始的核酸序列。反向引物对AIMV-CPxa03’末端特异(SEQxa0IDxa0NO:22)。依据制造商说明(Invitrogen公司)得到的扩增子被克隆进pENTR-D-TOPO载体。序列通过自动测序确认。验证序列后,依据制造商说明使用Invitrogen公司Gateway技术将靶基因重组进pAd/CMV/V5-DEST载体。实施例6含融合蛋白基因的腺病毒的制备使用Pac1消化纯化的pAd-HA3A-CPF或pAd-HA3C04-CPF质粒以暴露病毒末端反向重复序列(ITRs)。消化的pAd-HA3A-CPF或pAd-HA3C04-CPF被使用阳离子脂基转染试剂转染进293细胞系,所述293细胞系包含腺病毒E1的完整拷贝。当在转染的细胞中观察到病毒的病变效果时(转染后10-14天),收集含腺病毒的细胞和培养基。收集的含腺病毒的细胞和培养基被施以两次冻融循环过程(在-80°C30分钟随后在37°C15分钟)以裂解细胞并使细胞内病毒颗粒释放。在第二次冻/融循环之后,离心细胞裂解物并收集含病毒颗粒的上清并保存在-80°C。实施例7带HA3A-CPF和HA3C04-CPF序列的腺病毒构建体的转导方法以及无病毒颗粒的制备这是一个预言性实施例。实施例6中收获的含HA3A-CPF或HA3C04-CPF基因的腺病毒通过感染293细胞来扩增,随后按上面的描述再次收获和储存以制备腺病毒原液。使用空斑测定滴定腺病毒原液。由于pAd-HA3A-CPF和pAd-HA3C04-CPF腺病毒构建体没有复制能力且不能整合进宿主基因组,在其转导入哺乳动物细胞之后将不会产生子代病毒。宿主细胞可以是Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞,可以使MDCK细胞适应在无血清培养基中生长以避免最终制备中动物副产品污染的可能性。可以使用含HA3A-CPF或HA3C04-CPF序列的腺病毒转导MDCK细胞以确定适合的感染复数。转导2天或3天后,使用抗-HA和抗-AIMV抗体和随后的FITC偶联抗鼠IgG,通过荧光显微镜分析HA3A-CPF或HA3C04-CPF的表达。可选地,可以收集并离心细胞培养物上清以进行免疫印迹和融合蛋白的检测。为获得相对规模的HA3A-CPF或HA3C04-CPF的哺乳动物细胞产生平台,可以使用基于交联葡聚糖如GExa0Healthcare的CYTODEX^TM1的微载体系统在悬液中培养MDCK细胞。将腺病毒构建体转导之后,可以将MDCK细胞与微载体孵育并在转瓶中培养。2到3天后,每日收集细胞上清样品,使用靶特异性抗HA单克隆抗体通过免疫印迹分析表达水平。当确认了融合蛋白的存在时,可以收集MDCK培养基并离心。可以使用实施例3描述的程序,从PEG沉淀开始从上清中纯化融合蛋白。实施例8使用含H5HA(A/印度尼西亚/5/2005)球形域AMVxa0CP融合物的病毒样颗粒免疫小鼠在研究日第0和21天,使用5μg包含H5HA(A/印度尼西亚/5/2005)球形域AMVxa0CP融合物(HA3I-CPF)的病毒样颗粒(VLPs)皮下注射免疫几组6只6-8周龄的Balb/c小鼠。流感病毒印度尼西亚株的全长可溶HA(HAI1)也随或不随ALHYDROGEL^TM,作为比较注射。包含单独的CP作为阴性对照。疫苗在使用前刚制备。等份纯化的病毒样颗粒(或融合蛋白颗粒)在缓冲液中被解冻并随或不随佐剂ALHYDROGEL^TM注射。在研究日第35天收集血清样品并通过ELISA分析抗原特异性IgG同种型反应。在测试中,平板被覆盖以1∶128稀释度的,从CDC获得的灭活A/印度尼西亚/5/2005重配病毒。血清样品以4信稀释度铺在平板上。以相应OD值是阴性对照值3倍以上的稀释度,进行IgG1、IgG2a和IgG2b的终点滴定。结果表明,存在或不存在ALHYDROGEL^TM的含HA3I-CPF的病毒样颗粒,与存在或不存在ALHYDROGEL^TM的单独的可溶亚单位(HAI1)相比,诱导了更强的IgG2a反应(图7),这显示对VLPs免疫应答的Th1偏好。由于流感病毒感染的小鼠已显示产生Th1免疫应答,因此与可溶亚单位相比,植物产生的基于流感病毒HA球形域AMV的VLPs是更好的疫苗候选物。为测试HA3I-CPF疫苗引起的抗体的功能性,如Yokoxa0etxa0al.(Vaccinexa027:3467-3470,2009)描述进行血凝抑制(HI)检测。结果显示使用无ALHYDROGEL^TMHA3I-CPF免疫后35天,80%的小鼠具有>1∶40的HI滴度,这显著高于使用HAI1免疫的小鼠(p=0.003)(图8),这表明在无佐剂输送时与可溶性亚单位相比HA3I-CPF是更好的流感疫苗候选物。实施例9预先存在的针对CP的免疫力对小鼠血清抗体反应的影响在研究日第0和28天,带或不带佐剂ALHYDROGEL^TM(Alum),使用PBS或10μg含Pfs25-CPF的病毒样颗粒(VLPs)皮下(SC)或肌肉注射(IM)免疫几组6只6-8周龄的Balb/c小鼠,随后在研究日第140和168天,带或不带佐剂ALHYDROGEL^TM(Alum)使用PBS或1μg含H5HA(A/安徽/1/2005)球形域AMVxa0CP融合物(HA3I-CPF)的VLPs通过相同的施用途径免疫。疫苗在使用前刚制备。等份纯化的病毒样颗粒(或融合蛋白颗粒)在缓冲液中被解冻并随或不随佐剂ALHYDROGEL^TM注射。在研究前(预取血)和研究日第28、56、84、112、140、168和216天收集血清样品并通过ELISA分析抗原特异性IgG反应。在测试中,平板被覆盖上2μg/mLxa0AIMV、1μg/mL毕赤酵母中产生的重组Pfs25、或1∶128稀释度的,从CDC获得的灭活A/安徽/1/2005重配毒株。血清样品以4倍稀释度铺在平板上。以相应OD值是空白值4倍以上的稀释度,进行IgG的终点滴定。使用Pfs25-CPF,带或不带佐剂的两次免疫引起了抗AIMV(CP)的高IgG抗体滴度(>10,000),而且这些滴度在整个研究过程中保持。在使用带或不带佐剂的HA3A-CPF免疫之后,Pfs25-CPF预免疫组中抗AIMV(CP)的IgG滴度略微增加而PBS预免疫组中IgG滴度达到与Pfs25-CPF预免疫组等同的水平。使用Pfs25-CPF,带或不带佐剂的两次免疫引起抗Pfs25IgG抗体的高滴度(>10,000),其能够保持并且在使用Pfs25-CPF免疫后没有显著改变。使用Pfs25-CPF,通过SC或IM途径的两次免疫在所有组的血清中引起显著的抗-A/安徽/1/2005的IgG反应,除了使用PBS预免疫的组,该组中滴度比其他组中(>10,000)的低1或2个对数。为测试HA3A-CPF疫苗引起的抗体的功能性,如Yokoxa0etxa0al.(Vaccinexa027:3467-3470,2009)描述进行血凝抑制(HI)测定。结果显示使用HA3A-CPF的两次免疫在除阴性对照外(PBS/PBS)的所有组中诱导了血清HI抗体反应(图9A和9B)。不使用佐剂时,观察到使用Pfs25-CPF和PBS,通过SC(p=0.01)或IM(p=0.08)途径预免疫的组间HI滴度的显著差别。使用佐剂时,没有观察到使用Pfs25-CPF和PBS通过SC(p=0.5)或IM(p=0.6)途径预免疫的组间显著差别。基于这些结果,不使用ALHYDROGEL^TM作为佐剂,通过SC或IM途径,使用含植物病毒衣壳蛋白和第一靶蛋白的融合蛋白的VLPs进行预免疫,不干扰使用含相同植物病毒衣壳蛋白和第二靶蛋白的融合蛋白的VLPs进行再免疫,在小鼠中针对所述第二靶蛋白的血清HI抗体反应。尽管本文中依据具体实施方案展示和描述了本发明,但是其目的不是将本发明限制到所示的细节。相反,可以在权利要求等同的范围和区域内,对细节做各种修改而不背离本发明。ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="298"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="304"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="338"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="309"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="301"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="317"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="311"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="309"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="305"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="316"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="308"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="309"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" 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